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操作冻存管请严格按照使用说明来哦

发布时间:2022-05-16      点击次数:763
  使用冻存管储存样本时,严格要求应把冻存管放入液氮的气相层或冰箱中保存!如果冻存管储存于液氮液体中,液氮有一定几率会渗入冻存管内部,复苏时液氮气化导致管内外压力不平衡,这样极易造成冻存管的炸裂,并具有生物危害性。
  操作冻存管复苏,全程使用安全防护设备,建议穿实验服、戴棉质手套且在安全的实验台上进行操作。条件允许情况下,请佩戴护目镜或防护面罩。由于夏季室内温度会高于冬季,请格外小心。
  冻存管使用不当,会有爆管、生物安全威胁及人身伤害等风险,请严格参照安全使用须知操作!
  01细胞冻存流程
  1、用预热过的 PBS 对细胞进行冲洗,弃去 PBS 后,加入含 EDTA 的胰酶消化液对细胞进行消化(消化液薄薄地覆盖细胞表面即可,消化液浓度须根据不同的细胞系进行调整)。
  2、37℃消化细胞 3–5 分钟,不可过度消化。
  3、一旦细胞从底部脱离,即可用含血清培养基终止消化,并用吸管轻轻吹打以重悬细胞。
  4、离心(500 × g, 5 min)细胞重悬液以沉淀细胞,弃上清,用含血清培养基对细胞沉淀进行重悬。
  5、对细胞进行计数(推荐 Neubauer chamber)。
  6、离心(500 × g, 5 min)细胞重悬液,弃上清。用适当体积含血清培养基重悬细胞。
  7、将细胞重悬液以 1:1 比例与冻存液(60% 培养基,20% FCS,20% DMSO) 进行混合后转移至 Cryo.sTM 冻存管中。冻存管中细胞的浓度应为 1–5 ×10^6细胞/ml。
  8、含有细胞的冻存管须按照 −1 K/min 的冷却速率进行冷冻。将冻存管插在含异丙醇的冻存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以实现上述要求。如果 冻存液中含有其他类型的样品时,则需要将 Cryo.s 冻存管在−20℃,−70℃或者液氮的气相层进行直接冻存。为确保每个样品的均一冻存效 果,4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s冻存管需在−20℃过夜冻存后再转移至 70℃或者液氮的气相层。
  9、然后将 Cryo.s 冻存管转移至液氮罐。为避免污染(例如支原体)并考虑到安全预防规范的要求,建议将 Cryo.s 冻存管放置在液氮上方的气相层而非液氮层。
  02细胞复苏流程
  1、从液氮罐中取出冻存管后立即将其置于 37℃水浴中进行解冻,解冻时间约 1–2min,解冻时需要不停摇动冻存管令其尽快融化。此步解冻过程越快越好。
  2、将解冻好的细胞悬液转移到 15 ml 离心管,并立即添加一定量含血清培养基进行混合。
  3、离心(500 × g, 5 min)细胞重悬液,弃去上清。用适当体积的含血清培养基对细胞沉淀进行重悬后分装到 1 个或多个细胞培养瓶中。
  4、请遵循细胞接种时的推荐浓度进行培养。
  5、接下来的 12 个小时细胞需要静置培养。
  6、细胞换液可在 24–48h 后进行。
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